单纯疱疹病毒1型（HSV-1）脑炎（HSE）是典型的散发性疾病。尽管少见，HSE却是西方国家甚至全球最常见的偶发性病毒性脑炎。在未得到及时治疗的情况下,HSE的死亡率达%。目前临床上普遍采用阿昔洛韦治疗HSE，然而HSE幸存者都表现出严重的神经系统后遗症。前期研究发现了TLR3和DBR1介导的中枢神经系统细胞内源性免疫的先天性错误可分别导致前脑和脑干HSE。尽管如此，大多数HSE患者的突变基因仍然未知。
来自美国洛克菲勒大学研究团队采用全外显子组测序技术分析名不相关的HSE患者的基因，并选择了其他名非病毒感染性疾病以及例正常人基因数据库的作为比对，发现在HSE患者中的存在一些非常罕见的杂合突变，其中SNORA31的杂合突变在HSE群体中显著富集。SNORA31是一个具有个核苷酸的编码H/ACA类的核仁小RNA，它广泛表达于各种人类细胞类型，之前对其功能预测显示其可能参与了核小RNA和核糖体RNA中尿苷残基异构化为伪尿苷。在本研究中科学们利用使患者来源的诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的皮质神经元以及在胚胎干细胞中利用CRISPR/Cas9技术引入杂合或纯合的SNORA31缺失，揭示了SNORA31控制中枢神经系统神经元的固有免疫抵抗HSV-1的独特的机制(PMID:)。下面让我们来一起看看吧~研究内容人类SNORA31在一般人群中高度保守，研究人员利用（genedamageindex,GDI）评估了个snoRNA基因的结构变异。大多数snoRNA基因，表现出非常低的遗传多样性水平，其中SNORA31是5%最保守的SNORAs之一。在5名HSE患者患者中发现SNORA31存在4种变异形式且这四种SNORA31突变体的突变核苷酸均为高度保守的位点。突变体V1(P1，P2)所在位点为在14种脊椎动物中高度保守的核苷酸(78%保守)，而V2(P3)所在位点为的严格保守的核苷酸（%保守）。V3(P4)和V4(P5)都位于SNORA二级结构的茎内。通过分析计算SNORA31这四种变异体和其他49种变异体的二级结构最小自由能的变化，预测结果显示变异v1和v2是10个最不稳定的变异之一，而v3和v4对RNA结构没有显著影响。
研究人员首先在体外瞬时转染SNORA31野生型(WT)和突变型载体（MUT），RT-qPCR和northernblotting显示v1和v2的表达水平远低于WT型，v3和v4的表达量则是正常的。在突变患者的皮肤成纤维细胞中这四种变体的表达情况与HEKT细胞表达模式一致。同时研究人员使用CRISPR-Cas9技术在胚胎干细胞(hESC)引入SNORA31杂合或纯合突变体并分化为CNS神经元细胞，其中杂合子缺失的神经元中SNORA31表达水平降低50%，而纯合子缺失的细胞SNORA31表达完全缺失。由于SNORA31位于TPT1的第5内含子，因此也对TPT1的表达进行了分析，结果显示TPT1mRNA和蛋白水平均正常，另一个H/ACA类SNORA对照（SNORA34）表达水平也正常。研究人员随后对来自CNS皮质神经元的rRNA进行了伪尿苷谱分析和测序，其中93个注释伪尿嘧啶位点中的75个位点获得了可重复的伪序列信号，包括两个预测的SNORA31靶标位点18SrRNA中的U和28SrRNA中的U。纯合突变体中中U位点的假尿基化信号几乎消失而杂合子缺失对rRNA伪尿苷化无显著影响。另一方面，28SrRNA的U位点没有受到影响，即使在纯合子缺失的细胞中也是如此。通过对人类SNORA数据库的检索SNORA31B可引导序列与U互补，这表明SNORA31B可能会驱动CNS神经元中U位点的修饰。因此，本研究中直接证明了SNORA31在人类中枢神经皮质神经元中指导假尿嘧啶化修饰的作用，同时研究人员也推测，在HSE发病机制中SNORA31突变可能会涉及到U假尿嘧啶化修饰受损。SNORA31突变体对对HSV-1免疫的影响
研究团队检测患者来源的成纤维细胞对TLR3和IFN-α/β受体激动剂的免疫响应水平。在TLR3激动剂Poly(I：C)刺激下，来自P2-P5的SV40成纤维细胞能诱导产生正常水平的IL-29(IFN-λ1)和IL-6而不影响SNORA31的表达，同样IFN-β刺激下也不影响SNORA31的表达。但在患者细胞中HSV-1(Kos株)的复制水平与TLR3或STAT1缺陷患者细胞中的水平相似或更高，这说明P2-P5来源的成纤维细胞对HSV-1感染高度敏感。这些结果进一步表明SNORA31突变是一种不同于TLR3和STAT1缺陷的HSE的新机制。研究人员利用诱导多能干细胞技术在体外构建了患者来源的iPSC并衍化为神经元细胞。与健康的神经元相比，患者来源的神经元对HSV-1(KOS株)敏感，与TLR3和STAT1缺陷的神经元一样。最后，在SNORA31突变的和TLR3缺失的神经元中，可以通过IFN-β预处理来挽救该表型。因此，SNORA31突变患者的iPSC衍生的皮质神经元易受HSV-1感染，这可能为这一疾病的发生提供给了新的机制。在胚胎干细胞（HESC）中衍化的皮层神经元中，SNORA31纯合突变体中（del1和del2）SNORA31的表达被抑制，而其他杂合突变体中SNORA31的含量只有亲本的50%，或者几乎没有SNORA31的表达(hetdel5)。携带纯合子v2的神经元也完全没有SNORA31的表达，而对照SNORA34的表达以及TPT1mRNA或蛋白水平均无影响。研究人员发现由于SNORA31突变造成其表达水平完全缺失的细胞系中HSV-1的复制水平明显高于其他细胞。因此，杂合/纯合突变体中SNORA31的有害变异会造成SNORA31的低水平表达，进而导致对HSV-1的敏感性增强。SNORA31突变神经元对HSV-1和感染和免疫刺激剂的免疫响应水平鉴于snoRNA31的结构，它可能是一种细胞内源性的dsRNA并参与调节TLR3的活性。另外，在其他影响rRNA伪尿苷化的人类遗传疾病中，SNORA31缺陷可能会损害TLR3或IFNAR1/IFNAR2通路信号中重要的细胞mRNA编码分子的翻译。研究人员利用RNA-Seq技术对此进行了全面的评估。结果显示，SNORA31突变的神经元对TLR3和IFN-α/β刺激的免疫响应正常与健康的对照细胞表达模式一致。这些数据表明TLR3-和IFNAR1/IFNAR2介导的信号通路在SNORA31突变的皮质神经元中是正常的。HSV-1感染SNORA31突变的神经元和正常神经元后利用mRNA-Seq对细胞进行检测，结果显示在健康的对照神经元细胞中，GO分析显示上调的基因多富集在与免疫相关的通路上，而突变的神经元对HSV-1感染引起的免疫响应受损。因此，在SNORA31突变的细胞中，HSV-1感染后的转录组发生了改变。这可能是SNORA31突变的hiPSC来源的CNS神经元更容易受到影响的原因之一。全文链接：
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